قوش يۆنىلىشلىك RNA (dsRNA) ELISA KIT

بۇ يۈرۈشلۈك ئېنزىمغا باغلانغان ئىممۇنىتېت ئوپېراتسىيىسى (ELISA) بىئوتىن-سترېپتاۋىدىن سىستېمىسى بىلەن تۇتاشتۇرۇلغان بولۇپ ، تەرتىپنىڭ قانداق بولۇشىدىن قەتئىينەزەر ، ئۇزۇنلۇقى 60 ئاساسى جۈپ (bp) دىن يۇقىرى dsRNA نى مىقدارلاشتۇرۇپ ئۆلچەش ئۈچۈن.بۇ تەخسە ئالدىن dsRNA غا قارشى ئانتىتېلا بىلەن سىرلانغان.ئەۋرىشكە تەركىبىدىكى dsRNA قوشۇلۇپ قۇدۇققا چاپلانغان ئانتىتېلاغا باغلىنىدۇ.ئاندىن بىئوتىن بىرىكتۈرۈلگەن dsRNA ئانتىتېلاسى قوشۇلۇپ ئەۋرىشكە dsRNA بىلەن باغلىنىدۇ.يۇيۇپ بولغاندىن كېيىن ، HRP-Streptavidin قوشۇلۇپ ، Biotinylated dsRNA ئانتىتېلاسىغا باغلىنىدۇ.يوشۇرۇن ھالەتتە HRP-Streptavidin يۇيۇلغاندىن كېيىن.ئاندىن TMB تارماق بالا ئېرىتمىسى HRP تەرىپىدىن قوشۇلۇپ كاتالىزاتورلۇق قىلىپ ، كىسلاتالىق توختاش ئېرىتمىسىنى قوشقاندىن كېيىن سېرىق رەڭگە ئۆزگىرىدىغان كۆك رەڭلىك مەھسۇلات ھاسىل قىلىدۇ.سېرىقنىڭ زىچلىقى تەخسە تۇتۇلغان dsRNA نىڭ نىشان مىقدارىغا ماس كېلىدۇ.سۈمۈرۈلۈش مىقدارى 450 nm.

ئىلتىماس

بۇ يۈرۈشلۈك قالدۇق dsRNA نى مىقدارلاشتۇرۇپ ئۆلچەش ئۈچۈن.

يۈرۈشلۈك زاپچاسلار

ساقلاش ۋە مۇقىملىق

1. ئىشلىتىلمىگەن يۈرۈشلۈك زاپچاسلار ئۈچۈن: پۈتكۈل زاپچاسلارنى ساقلاش مۇددىتى 2 ~ 8 at دە ساقلىغىلى بولىدۇ.ساقلاش مۇقىملىقى ئۈچۈن كۈچلۈك نۇردىن ساقلىنىش كېرەك.

2. نىمكەش زاپچاسلار ئۈچۈن: مىكرو پىلاستىنكا ئېچىلغاندىن كېيىن ، ئىشلىتىلمىگەن قۇدۇقلارنى تەخسە پېچەتلىگۈچ بىلەن يېپىپ ، يوقىتىش دورىسى قاچىلانغان ياپقۇچ خالتىغا قايتىڭ ، ياپقۇچ خالتىنى پوچتا بىلەن پېچەتلەپ ، ئىشلىتىپ بولغاندىن كېيىن تېزرەك 2 ~ 8 return گە قايتىڭ.باشقا رېئاكتورلارنى ئىشلىتىپ بولغاندىن كېيىن تېزرەك 2 ~ 8 to گە قايتۇرۇش كېرەك.

تەلەپ قىلىنغان ، ئەمما تەمىنلەنمىگەن ماتېرىياللار

1. 450 ± 10nm سۈزگۈچ بار مىكروپراتور ئوقۇغۇچ (450 ۋە 650 nm دولقۇن ئۇزۇنلۇقىنى بايقىيالىسىڭىز تېخىمۇ ياخشى).

2. مىكرو دولقۇنلۇق تەۋرىنىش.

3. RNase يوق كۆرسەتمىلەر ۋە مەركەزدىن قاچۇرۇش نەيچىسى.

Flowchart مەشغۇلاتى

باشلاشتىن بۇرۇن

1. ئىشلىتىشتىن بۇرۇن بارلىق زاپچاس زاپچاسلىرى ۋە ئەۋرىشكىلەرنى ئۆينىڭ تېمپېراتۇرىسىغا (18-25 ℃) ئېلىپ كېلىڭ.ئەگەر بۇ زاپچاس بىر قېتىمدىلا ئىشلىتىلمىسە ، پەقەت ھازىرقى تەجرىبە ئۈچۈن بەلۋاغ ۋە رېئاكتورنى چىقىرىپ ، قالغان بەلۋاغ ۋە رېئاكتورنى تەلەپكە قويۇپ قويۇڭ.

2. يۇيۇش سۇيۇقلۇقى: 40mL 20 × قويۇق يۇيۇش سۇيۇقلۇقىنىڭ 760mL دىن ئايرىۋېتىلگەن ياكى پارچىلانغان سۇ بىلەن سۇيۇلدۇرۇپ ، 800mL 1 × يۇيۇش سۇيۇقلۇقى تەييارلىنىدۇ.

3. ئۆلچەملىك: ئىشلىتىشتىن بۇرۇن پاي ھەل قىلىش چارىسىنى قىسقىچە ئايلاندۇرۇش ياكى مەركەزلەشتۈرۈش.تەمىنلەنگەن تۆت ئۆلچەمنىڭ قويۇقلۇقى 5ng / μL.UTP ۋە pUTP dsRNA ئۆلچىمىگە نىسبەتەن ، STE بۇففېر بىلەن STE بۇففېر بىلەن پاي ھەل قىلىش چارىسىنى 1،0.5،0.25،0.125,0.0625,0.0312,0.0156,0pg / μL غا سۇيۇلدۇرۇڭ.N1-Me-pUTP dsRNA ئۆلچىمىگە نىسبەتەن ، ئۆلچەملىك ئەگرى سىزىق سىزىش ئۈچۈن پاي ھەل قىلىش چارىسىنى 2،1،0.5،0.25،0.125,0.0625,0.0312 ، 0pg / μL غا سۇيۇلدۇرۇڭ.5-OMe-UTP dsRNA ئۆلچىمى ئۈچۈن ، ئۆلچەملىك ئەگرى سىزىق سىزىش ئۈچۈن پاي ھەل قىلىش چارىسىنى 4،2،1،0.5 ، 0.25،0.125،0.0625 ، 0pg / μL غا سۇيۇلدۇرۇڭ.ئۆلچەمنى تۆۋەندىكى دىئاگراممىلاردا سۇيۇلدۇرۇشنى تەۋسىيە قىلىمىز:

4. بىئوتىن بىرىكتۈرۈلگەن بايقاش ئانتىتېلاسى ۋە HRP-streptavidin خىزمەت ئېرىتمىسى: ئىشلىتىشتىن بۇرۇن زاپاس ئېرىتمىنى قىسقا ئايلاندۇرۇش ياكى مەركەزلەشتۈرۈش.ئۇلارنى سۇيۇقلۇق بۇففېر بىلەن خىزمەت قويۇقلۇقىغا توغرىلاڭ.

5. TMB تارماق ئېلېمېنتى: كېرەكسىز مىقداردىكى ئېرىتمە ئارقىلىق ھەل قىلىش چارىسىنى ئارزۇ قىلىڭ ، قالدۇق ئېرىتمىنى قاچىغا قايتا تاشلىماڭ.TMB تارماق ئېغىزى نۇرغا سەزگۈر ، ئۇزۇن مۇددەت TMB تارماق يولىنى يورۇقلۇققا چىقارماڭ.

كېلىشىم ئىشلىتىش

1. تەكشۈرۈشكە كېرەكلىك بەلۋاغ سانىنى ئېنىقلاڭ.ئىشلىتىش ئۈچۈن رامكىلارغا بەلگە قىستۇرۇڭ.بۇ جەدۋەلدە ئىشلىتىلمىگەن قالدۇق تاختايلارنى خالتىغا قاچىلانغان دورا بىلەن قاچىلاش كېرەك.توڭلاتقۇنى ساقلاش ئۈچۈن سومكىنى مەھكەم تاقاڭ.

2. مۇۋاپىق قۇدۇقلارغا ئۆلچەملىك ، قۇرۇق ۋە ئەۋرىشكەلەرنىڭ ھەر بىرىنى 100μL قوشۇڭ.تەخسە پېچەتلىگۈچى بىلەن يېپىش.ئۆي تېمپېراتۇرىسىدا 1 سائەت سىلكىنىش ، كەچ سائەت 500 دە تەۋرىنىش.ئەۋرىشكەلەرنى STE بۇففېر بىلەن سۇيۇقلاندۇرۇپ ، مۇۋاپىق قويۇقلاشتۇرۇش كېرەك.

3. يۇيۇش باسقۇچى: ھەل قىلىش چارىسىنى ئارزۇ قىلىپ ، ھەر بىر قۇدۇققا 250 مىللىمېتىرلىق يۇيۇش سۇيۇقلۇقى بىلەن يۇيۇپ ، 30-ئورۇنغا قويۇڭ.تاختاينى سۈمۈرگۈچ قەغەزگە ئۇرۇپ يۇيۇش سۇيۇقلۇقىنى پۈتۈنلەي تاشلاڭ.4 قېتىم پۈتۈنلەي يۇيۇش.

4. ھەر بىر قۇدۇققا 100μL بىئوتىن بىرىكتۈرۈلگەن ئانتىتېلا خىزمەت ئېرىتمىسى قوشۇڭ.تەخسە پېچەتلىگۈچى بىلەن يېپىش.ئۆي تېمپېراتۇرىسىدا 1 سائەت سىلكىنىش ، كەچ سائەت 500 دە تەۋرىنىش.

5. يۇيۇش قەدىمىنى تەكرارلاڭ.

6. ھەر بىر قۇدۇققا 100μL HRP-streptavidin خىزمەت ھەل قىلىش چارىسىنى قوشۇڭ.تەخسە پېچەتلىگۈچى بىلەن يېپىش.ئۆينىڭ تېمپېراتۇرىسىدا 30 مىنۇت سىلكىنىش ، كەچ سائەت 500 دە تەۋرىنىش.

7. يۇيۇش قەدىمىنى قايتا تەكرارلاڭ.

8. ھەر بىر قۇدۇققا 100μL TMB تارماق ئېرىتمىسى قوشۇڭ.تەخسە پېچەتلىگۈچى بىلەن يېپىش.RT دا 30 مىنۇت يوشۇرۇن ھالەتتە نۇردىن ساقلىنىڭ.سۇيۇقلاندۇرۇلغان ئېرىتمىنى قوشقاندا سۇيۇقلۇق كۆك رەڭگە كىرىدۇ.

9. ھەر بىر قۇدۇققا 50μL توختىتىش ھەل قىلىش چارىسىنى قوشۇڭ.توختاش ئېرىتمىسىنى قوشۇش ئارقىلىق سۇيۇقلۇق سېرىق رەڭگە كىرىدۇ.ئاندىن مىكرو پىلاستىنكا ئوقۇغۇچنى ئىجرا قىلىپ ، دەرھال 450nm دە ئۆلچەش ئېلىپ بېرىڭ.

نەتىجىنى ھېسابلاش

1. ھەر بىر ئۆلچەم ، كونترول ۋە ئەۋرىشكە ئۈچۈن تەكرارلانغان ئوقۇشلۇقنى ئوتتۇرىچە ھېسابلاپ ، ئوتتۇرىچە نۆل ئۆلچەملىك ئوپتىكىلىق زىچلىقىنى ئېلىڭ.تىك (Y) ئوقىدا سۈمۈرۈلۈش ۋە توغرىسىغا (X） ئوق) dsRNA قويۇقلۇقى بىلەن ئۆلچەملىك ئەگرى سىزىق ھاسىل قىلىڭ.

2. ئەگرى سىزىق مۇتەخەسسىسى 1.3 ياكى ELISA Calc قاتارلىق كومپيۇتېرنى ئاساس قىلغان ئەگرى سىزىقلىق يۇمشاق دېتاللار بىلەن ھېسابلاشنى 5 ياكى 4 پارامېتىرلىق سىزىقسىز ماس مودېلدا ئىشلەش تەۋسىيە قىلىنىدۇ.

ئىقتىدار

1. سەزگۈرلۈك:

بايقاشنىڭ تۆۋەن چېكى: ≤ 0.001pg / μL (UTP- ، pUTP- ، N1-Me-pUTP-dsRNA ئۈچۈن) ، .01 0.01pg / μL (5-OMe-UTP-dsRNA ئۈچۈن).

مىقدارنىڭ تۆۋەن چېكى: 0.0156 pg / μL (UTP- ، pUTP-dsRNA ئۈچۈن) ، 0.0312 pg / μL (N1-Me-pUTP-dsRNA ئۈچۈن) ، 0.0625 pg / μL (5-OMe-UTP-dsRNA ئۈچۈن).

2. ئېنىقلىق: ئىچكى قىسىمدىكى CV ≤% 10 ، ئارىلاپ تەكشۈرۈشنىڭ CV ≤% 10

3. ئەسلىگە كېلىش:% 80 ~% 120

4. سىزىق: 0.0156-0.5pg / μL (forUTP-, pUTP-dsRNA) 0.0312-1pg / μL (forN1-Me-pUTP dsRNA) ، 0.0625-1pg / μL (5-OMe-UTP-dsRNA).

ئويلىنىش

1. TMB رېئاكسىيە تېمپېراتۇرىسى ۋە ۋاقتى ئىنتايىن مۇھىم ، كۆرسەتمىگە ئاساسەن ئۇلارنى كونترول قىلىڭ.

2. ياخشى بولغان كۆپىيىشچانلىقى ۋە سەزگۈرلۈكىنى قولغا كەلتۈرۈش ئۈچۈن ، تەخسىنى مۇۋاپىق يۇيۇپ ، رېئاكسىيە قىلىنمىغان رېئاكتورنى يوقىتىش تولىمۇ مۇھىم.

3. ئىشلىتىشتىن بۇرۇن بارلىق رېئاكتورلارنى ئوبدان ئارىلاشتۇرۇپ ، ئەۋرىشكە ياكى رېئاكتور قوشۇش جەريانىدا داۋالغۇشتىن ساقلىنىش كېرەك.

4. ئەگەر قويۇق يۇيۇش سۇيۇقلۇقى (20x) دە خرۇستال شەكىللەنگەن بولسا ، 37 warm غىچە قىزىتىپ ، خرۇستال پۈتۈنلەي ئېرىپ بولغۇچە يۇمشاق ئارىلاشتۇرۇڭ.

5. ناترىي ئازدې (NaN3) بولغان ئەۋرىشكەلەرنى تەكشۈرۈشتىن ساقلىنىڭ ، چۈنكى ئۇ HRP پائالىيىتىنى بۇزۇپ تاشلاپ ، dsRNA نىڭ مىقدارىنى تۆۋەن مۆلچەرلەپ قويىدۇ.

6. تەكشۈرۈش جەريانىدا RNase نىڭ بۇلغىنىشىدىن ساقلىنىڭ.

7. ئۆلچەملىك / ئەۋرىشكە ، تەكشۈرۈش ئانتىتېلاسى ۋە SA-HRP نىمۇ تەۋرىتمەي RT دا ئېلىپ بارغىلى بولىدۇ ، ئەمما بۇ بايقاش سەزگۈرلۈكىنىڭ بىر ھەسسە تۆۋەنلىشىنى كەلتۈرۈپ چىقىرىشى مۇمكىن.بۇ خىل ئەھۋالغا قارىتا ، بىز UTP ۋە pUTP dsRNA ئۆلچىمىنىڭ 2pg / μL دىن سۇيۇلدۇرۇلۇشىنى ، N1-Me-pUTP dsRNA ئۆلچىمىنىڭ 4pg / μL دىن ، 5-OMe-UTP dsRNA ئۆلچىمىنىڭ 8pg / μL دىن سۇيۇلدۇرۇلۇشىنى تەۋسىيە قىلىمىز.ئۇنىڭدىن باشقا ، HRP-streptavidin خىزمەت ئېرىتمىسىنى ئۆي تېمپېراتۇرىسىدا 60 مىنۇت تۇرغۇزۇڭ.چاقماق لامپىنى ئىشلەتمەڭ ، چۈنكى چاقماق لامپا توغرا بولمىغان نەتىجىنى كەلتۈرۈپ چىقىرىشى مۇمكىن.

تىپىك نەتىجە

1. ئۆلچەملىك ئەگرى سانلىق مەلۇمات

2. ئۆلچەملىك ئەگرى ھېسابلاش

3. سىزىقنى تەكشۈرۈش دائىرىسى: 0.0312- 1pg / μL