M-MLV تەتۈر ترانسكرىپسىيەسى
RevScript تەتۈر كۆچۈرۈلمە گېن قۇرۇلۇشى تېخنىكىسى ئارقىلىق ئېرىشىدۇ.ئۇنىڭ يۇقىرى CDNA بىرىكتۈرۈش ئىقتىدارى ، ئىسسىقلىق مۇقىملىقى ۋە رېئاكسىيە تېمپېراتۇرىسى (° C60 قا يېتىدۇ) بار.بىرىكتۈرۈلگەن cDNA مەھسۇلاتى 10 kb غا يېتىدۇ.ئۇ قېلىپلارنىڭ يېقىنلىقىنى ئاشۇرىدۇ ھەمدە مۇرەككەپ ئىككىلەمچى قۇرۇلما ياكى تۆۋەن كۆپەيتىلگەن گېن بىلەن RNA قېلىپىنى تەتۈر كۆچۈرۈشكە ماس كېلىدۇ.
زاپچاسلار
| زاپچاس | HC2003B-01 (10,000U) | HC2003B-02 (5 * 10,000U) | HC2003B-03 (200,000U) |
| RevScript تەتۈر ترانسكرىپسىيەسى (200U / μL) | 50 μL | 5 × 50 μL | 1 mL |
| 5 × RevScript Buffer | 250 μL | 1.25 mL | 5 mL |
ساقلاش ھالىتى
بۇ مەھسۇلاتنى -25 ° C ~ -15 ° C قا 2 يىل ساقلاش كېرەك.
بىرلىك ئېنىقلىمىسى
بىر ئورۇن Oligo (dT) نى پىرىمېر قىلىپ ئىشلىتىپ ، 10 سېلسىيە گرادۇستا 10 مىنۇتتا 1 nmol dTTP نى كىسلاتادا ئېرىمەس ماتېرىيالغا ئۆز ئىچىگە ئالىدۇ.
ئىنكاس تەڭشەش
1. RNA قېلىپىنى تەڭشەش (بۇ باسقۇچ ئىختىيارى ، RNA قېلىپىنى ئايرىش ئىككىنچى قۇرۇلمىنى ئېچىشقا ياردەم بېرىدۇ ، بۇ بىرىنچى تال CDNA نىڭ مەھسۇلات مىقدارىنى ئۆستۈرىدۇ.)
| زاپچاسلار | توم (μL) |
| RNase free ddH2O | To 13 |
| Oligo (dT)18 (50 μ mmol / L) ياكى Random Primer (50 μmol / L) ياكى گېن ئالاھىدە پىرىمېرلىرى (2 μ mmol / L) | 1 |
| ياكى 1 | |
| ياكى 1 | |
| RNA قېلىپى | X.a |
ئىزاھات:
1) a: ئومۇمىي RNA: 1-5 ug ياكى mRNA: 1-500 ng
2) ° C 65 سېلسىيە گرادۇستا 5 مىنۇت تۇرغۇزۇڭ ، ئاندىن مۇز ئۈستىدە دەرھال يۆتكىلىپ 2 مىنۇت سوۋۇتۇڭ.رېئاكسىيە سۇيۇقلۇقىنى يىغىش ئۈچۈن قىسقىچە مەركەزلەشتۈرۈش ، تۆۋەندىكى جەدۋەلدە كۆرسىتىلگەندەك تەتۈر كۆچۈرۈلۈش رېئاكسىيەسىنى قوشۇڭ.ئاستا-ئاستا تۇرۇبا ئارىلاشتۇرۇڭ.
1. رېئاكسىيە ئارىلاشمىسىنى تەييارلاش (20 مىللىمېتىر)
| زاپچاسلار | توم (μL) |
| ئالدىنقى باسقۇچنىڭ ئارىلاشمىسى | 13 |
| 5 × Buffer | 4 |
| dNTP Mix (10nmol / L) | 1 |
| تەتۈر ترانسكرىپسىيەسى (200 U / μL) | 1 |
| RNase inhibitor (40 U / μL) | 1 |
1.تۆۋەندىكى شەرت ئاستىدا ئىنكاس قايتۇرۇڭ:
| تېمپېراتۇرا (° C) | ۋاقىت |
| 25 ° C.a | 5 مىنۇت |
| 42 ° C.b | 15-30 مىنۇت |
| 85 ° C.c | 5 مىنۇت |
ئىزاھات:
1) a.5 سېلسىيە گرادۇسلۇق 25 سېلسىيە گرادۇسلۇق ھاۋارايى پەقەت ئىختىيارى ئالتە تەرەپلىك ئىشلىتىش ئۈچۈنلا تەلەپ قىلىنىدۇ.Oligo (dT) نى ئىشلەتكەندە بۇ باسقۇچتىن ئاتلاڭ18ياكى Gene Specific Primer.
2) b.تەۋسىيە قىلىنغان تەتۈر ترانسكرىپسىيەنىڭ تېمپېراتۇرىسى 42 سېلسىيە گرادۇس ، مۇرەككەپ ئىككىلەمچى قۇرۇلما ياكى GC مىقدارى يۇقىرى قېلىپلارغا نىسبەتەن ، ئىنكاس تېمپېراتۇرىسىنى 50-55 سېلسىيە گرادۇسقا ئۆرلىتىش تەۋسىيە قىلىنىدۇ.
3) c.85 سېلسىيە گرادۇستا 5 مىنۇت قىزىتىپ ، تەتۈر كۆچۈرۈلۈش ئاكتىپسىزلىنىدۇ.
4) بۇ مەھسۇلاتنى بىۋاسىتە PCR ياكى qPCR رېئاكسىيەسىدە ئىشلىتىشكە بولىدۇ ، ياكى -20 سېلسىيە گرادۇستا قىسقا مۇددەت ساقلاشقا بولىدۇ.ئۇزۇن مۇددەت ساقلاش ئۈچۈن مەھسۇلاتلارنى توغرىلاپ ، ° C80- ° C قا ساقلاش تەۋسىيە قىلىنىدۇ.دائىم توڭلاپ قېلىشتىن ساقلىنىڭ.
5) بۇ مەھسۇلات بىر باسقۇچلۇق RT-qPCR غا ماس كېلىدۇ ، ھەر 25μL رېئاكسىيە سىستېمىسىغا 10-20 U تەتۈر كۆچۈرۈلۈش قوشۇش ياكى ئەمەلىي ئەھۋالغا ئاساسەن تەتۈر كۆچۈرۈلۈش مىقدارىنى تەدرىجىي ئاشۇرۇش تەۋسىيە قىلىنىدۇ.
ئىزاھات
1.تەجرىبە رايونىنى پاكىز تۇتۇڭ.مەشغۇلات جەريانىدا پاكىز پەلەي ۋە ماسكا تاقاش كېرەك.سىناقتا ئىشلىتىلگەن بارلىق ئىستېمال بۇيۇملىرى RNase نىڭ بۇلغىنىشىنىڭ ئالدىنى ئېلىش ئۈچۈن ئەركىن بولۇشى كېرەك.
2. بارلىق رەسمىيەتلەرنى مۇز ئۈستىدە ئېلىپ بېرىپ ، RNA نىڭ بۇزۇلۇشىنىڭ ئالدىنى ئېلىش كېرەك.
3. يۇقىرى سۈپەتلىك RNA ئەۋرىشكىسى تەتۈر كۆچۈرۈلۈشنىڭ يۇقىرى ئۈنۈمىگە كاپالەتلىك قىلىش تەۋسىيە قىلىنىدۇ.
4.بۇ مەھسۇلات پەقەت تەتقىقات ئۈچۈن ئىشلىتىلىدۇ.
5. بىخەتەرلىكىڭىز ئۈچۈن تەجرىبىخانا چاپان ۋە بىر قېتىم ئىشلىتىلىدىغان پەلەي بىلەن مەشغۇلات قىلىڭ.
