mRNA Cap2'-O-Methyltransferase
mRNA Cap 2´ -O-methyltransferase ۋاكسىنىنىڭ mRNA Cap 2 ´-O-Methyltransferase ۋاكسىنىسىنىڭ گېنىنى توشۇيدىغان قايتا ھاسىل قىلىدىغان E. coli بېسىمدىن ھاسىل بولغان.بۇ خىل ئېنزىم RNA نىڭ 5´end دىكى قاپارتما قۇرۇلمىسىغا قوشنا بولغان بىرىنچى يادرونىڭ 2´-O ئورنىدا مېتىل گۇرۇپپىسىنى قوشىدۇ. بۇ ئېنزىم S-adenosylmethionine (SAM) نى مېتىل تەقدىم قىلغۇچى RNA غا ئىشلىتىلىدۇ -0) نەتىجىدە cap- 1 قۇرۇلمىسى بارلىققا كېلىدۇ.
Cap1 قۇرۇلمىسى تەرجىمە ئۈنۈمىنى يۇقىرى كۆتۈرەلەيدۇ ، mRNA نىڭ ئۇلىنىش ۋە مىكرو ئوكۇل تەجرىبىسىدىكى ئىپادىسىنى ياخشىلايدۇ. بۇ ئېنزىم مەخسۇس m7GpppN دوپپىسى بىلەن RNA نى تەلەپ قىلىدۇ.ئۇ 5´ ئاخىرىدا pN ، ppN ، pppN ياكى GpppN ئارقىلىق RNA نى ئىشلىتەلمەيدۇ.قاپلانغان RNA دوپپا ئوخشىتىش ئارقىلىق ياكى ۋاكسىنا قاپلاش فېرمېنتى ئارقىلىق فېرمېنتلىق قاپلاش ئارقىلىق تەييارلىنىدۇ.
زاپچاسلار
mRNA Cap 2´-O-Methyltransferase (50U / μL)
10 × قاپلاش رېئاكسىيەسى
ساقلاش
ساقلاش ئۈچۈن -25 ～ - 15 repeated قايتا-قايتا توڭلىتىش دەۋرىدىن ساقلىنىڭ）
ساقلىغۇچ
20 mM Tris-HCl （pH 8.0，25 ℃) ، 100 mM NaCl ، 1 mM DTT ، 0. 1 mM EDTA ، 0. 1% Triton X- 100 ， 50% گلىتسېرىن.
بىرلىك ئېنىقلىمىسى
بىر بىرلىك 37 سېلسىيە گرادۇسلۇق 1 سائەتتە 80 nt قاپلانغان RNA خاتىرىسىنىڭ 10 پومولنى مېتىللاش ئۈچۈن كېرەكلىك ئېنزىمنىڭ مىقدارى دەپ ئېنىقلىما بېرىلگەن.
سۈپەت كونترول قىلىش
Exonuclease: 50U mRNA Cap 2 ´ -O-Methyltransferase بىلەن 1μg λ-Hind III ھەزىم قىلىش DNA 37 37 at 16 سائەت 16 سائەت ئىچىدە ئاگاروزا گېلى ئېلېكتروفورىسى تەرىپىدىن بەلگىلىنىدىغان بۇزۇلمايدۇ.
Endonuclease: 50 U mRNA Cap 2 ´ -O-Methyltransferase بىلەن 1 μg λDNA 37 at 16 سائەت 16 سائەت 16 سائەت ئىچىدە ئاگاروزا گېلى ئېلېكتروفورىسى تەرىپىدىن بەلگىلىنىدىغان بۇزۇلۇش پەيدا قىلمايدۇ.
Nickase: 50U mRNA Cap 2 ´ -O-Methyltransferase بىلەن 1μg pBR322 37 37 at 16 سائەت 16 سائەت ئىچىدە ئاگاروزا گېلى ئېلېكتروفورىسى تەرىپىدىن بېكىتىلگەن بۇزۇلمايدۇ.
RNase: 50U mRNA Cap 2 ´ -O-Methyltransferase بىلەن 1.6μg MS2 RNA بىلەن 37 سائەت 4 سائەت 4 سائەت ئىچىدە ، ئاگاروزا گېلى ئېلېكتروفورىسى تەرىپىدىن بېكىتىلگەن بۇزۇلۇش پەيدا قىلمايدۇ.
E. coli DNA: 50U mRNA Cap 2 ´ -O-Methyltransferase نىڭ بار-يوقلۇقى تەكشۈرۈلىدۇE. coli TaqMan qPCR نى ئىشلىتىپ گېنتىكىلىق DNAE. coli 16S rRNA ئورنى.TheE. coli گېن گۇرۇپپىسىنىڭ DNA بۇلغىنىشى = 1E. coli genome.
باكتېرىيە Endotoxin: LAL- سىناق ، جۇڭگونىڭ Pharmacopoeia IV 2020 نەشرىگە ئاساسەن ، گېلى چەكلەش ئۇسۇلى ، ئومۇمىي قائىدە (1143).باكتېرىيەنىڭ ئىچكى ئاجراتما مىقدارى = 10 EU / mg بولۇشى كېرەك.
ئىنكاس سىستېمىسى ۋە شەرتلىرى
1. مۇۋاپىق مىقداردا Capped RNA ۋە RNase-free H2O نى 1.5 مىللىلىتىرلىق مىكرو تۇرۇبا تۇرۇبىسىدا ئەڭ ئاخىرقى 16.0 µL غا بىرلەشتۈرۈڭ.
2. 65 at 5 مىنۇتتا 5 مىنۇت قىزىتىڭ ، ئاندىن مۇز مۇنچىسىدىن 5 مىنۇت تۇرغۇزۇڭ.
3. كۆرسىتىلگەن تەرتىپ بويىچە تۆۋەندىكى زاپچاسلارنى قوشۇڭ (Capped RNA نىڭ مېتىللىنىشى ئۈچۈن)
10 دىن تۆۋەن
| زاپچاس | ھەجىم |
| رەتلەنگەن RNA | 16 μL |
| 10X Capping Reaction Buffer * | 2 μL |
| SAM (4 mM) | 1 μL |
| mRNA Cap 2´-O-Methyltransferase (50 U / μL) | 1 μL |
| ddH2O | 20 μL |
* 10 aping Capping Reaction Buffer: 500 mM Tris-HCl (pH 8.0, 25 ℃), 50 mM KCl, 10 mM MgCl2 、 10 mM DTT.
4. 37 at غىچە 1 سائەت (200 سائەتتىن تۆۋەن نىشان بۆلەك ئۈچۈن 2 سائەت يوشۇرۇن تەۋسىيە قىلىنىدۇ).
قوللىنىشچان پروگراممىلار
مىكرو ئوكۇل سېلىش ۋە ئالماشتۇرۇش تەجرىبىسى جەريانىدا mRNA ئىپادىسىنى ياخشىلاش.
ئىشلىتىش خاتىرىسى
1. ئىنكاس قايتۇرۇشتىن بۇرۇن ، RNA نى پاكىزلاش ۋە يادروسىز سۇدا ئېرىتىش كېرەك ، بارلىق ھەل قىلىش چارىلىرىدا ھېچقانداق EDTA ۋە ئىئون بولماسلىقى كېرەك.
2. ئەۋرىشكە RNA نىڭ 65 at نى 5 مىنۇتتا 5 مىنۇت قىزىتىش تەۋسىيە قىلىنىدۇ.مۇرەككەپ 5 ´ تېرمىنال قۇرۇلمىسى ئۈچۈن ئۇنى 10 مىنۇتقا ئۇزارتقىلى بولىدۇ.
