RTL تەتۈر ترانسكرىپسىيەسى
RTL تەتۈر كۆچۈرۈلگەن RNA قېلىپىغا تايىنىدىغان DNA پولىمېراسى بولۇپ ، ئۇنىڭدا 3 '→ 5' تاشقى كۆرۈنۈش پائالىيىتى كەمچىل ، RNase H پائالىيىتى بار.بۇ فېرمېنت RNA نى قېلىپ قىلىپ ، DNA نىڭ تولۇقلىما بىرىكمىسىنى بىرىكتۈرەلەيدۇ ، بۇ بىرىنچى قاتاردىكى cDNA بىرىكتۈرۈشكە ئىشلىتىلىدۇ ، بولۇپمۇ RT-LAMP (ئايلانما ۋاسىتىلىك ئىسسىقلىق ئارقىلىق كېڭەيتىش).RTL تەتۈر كۆچۈرۈلگەن 1.0 گە سېلىشتۇرغاندا ، سەزگۈرلۈك كۆرۈنەرلىك ياخشىلاندى ، ئىسسىقلىقنىڭ مۇقىملىقى تېخىمۇ كۈچلۈك ، ° C 65 دىكى ئىنكاس تېخىمۇ مۇقىم.RTL تەتۈر ترانسكرىپسىيەسى (گلىتسېرىن ھەقسىز) لىمفىللانغان تەييارلىق ، لىيوفىللانغان RT-LAMP رېئاكتورى قاتارلىقلارنى تەييارلاشقا ئىشلىتىلىدۇ.
بىرلىك ئېنىقلىمىسى
بىر بۆلەك 20 مىنۇتتا 50 سېلسىيە گرادۇسلۇق يۇقىرى تېمپېراتۇرىدا 1 nmol dTTP نى كۆپ مىقداردا (A) • oligo (dT) 25 نى قېلىپلاشتۇرغۇچ قىلىپ ئۆز ئىچىگە ئالىدۇ.
زاپچاسلار
| زاپچاس | HC5008A-01 | HC5008A-02 | HC5008A-03 |
| RTL تەتۈر ترانسكرىپسىيەسى (گلىتسېرىنسىز) (15U / μL) | 0.1 mL | 1 mL | 10 mL |
| 10 × HC RTL Buffer | 1.5 mL | 4 × 1.5 mL | 5 × 10 mL |
| MgSO4 (100mM) | 1.5 mL | 2 × 1.5 mL | 3 × 10 mL |
ساقلاش ھالىتى
0 سېلسىيە گرادۇستىن تۆۋەن توشۇش -25 ° C ~ -15 ° C قا ساقلىنىدۇ.
سۈپەت كونترول
- قالدۇق پائالىيەتEndonuclease:1 μg λDNA ۋە 15 بىرلىك RTL2.0 نى ئۆز ئىچىگە ئالغان 50 μL رېئاكسىيەسى 37 سائەتتە 16 سائەت ئىنكۇبلانغان بولۇپ ، گېلى ئېلېكتروفورېزنىڭ پاسسىپ كونتروللۇقى بىلەن ئوخشاش.
- قالدۇق پائالىيەتExonuclease:50 μL لىق رېئاكسىيە تەركىبىدە 1 μg Hind Ⅲ ھەزىم قىلىنغان λDNA ۋە 15 بىرلىك RTL2.0 نىڭ 37 سائەت 16 سائەت 16 سائەت سىلىندى.
- قالدۇق پائالىيەتNickase:50 μL رېئاكسىيەسى 1 μg دەرىجىدىن تاشقىرى pBR322 ۋە 15 دانە RTL2.0 نىڭ 4 سېلسىيە گرادۇس 37 سېلسىيە گرادۇستا 4 سائەت ئىنكۇبلانغان.
- قالدۇق پائالىيەتRNase:MS2 RNA نىڭ 0.48 mgg ۋە 15 بىرلىك RTL2.0 نىڭ 10 سېلسىيە گرادۇسلۇق تېمپېراتۇرىسى 37 سېلسىيە گرادۇستا 4 سائەت سىڭدۈرۈلگەن بولۇپ ، گېلى ئېلېكتروفورېزىنىڭ پاسسىپ كونتروللۇقى بىلەن ئوخشاش.
- E. coli gDNA:بىلەن ئۆلچەنگەنE.coliكونكرېت HCD بايقاش زاپچاسلىرى RT 15 بىرلىك RTL2.0 نىڭ مىقدارى 1 دىن تۆۋەنE. coligenome.
ئىنكاس تەڭشەش
cDNA بىرىكمە كېلىشىم
| زاپچاسلار | ھەجىم |
| قېلىپ RNA a | ئىختىيارىي |
| Oligo (dT) 18 ~ 25 (50uM) ياكى ئىختىيارى Primer ئارىلاشمىسى (60uM) | 2 μL |
| dNTP Mix (ھەر بىرى 10mM) | 1 μL |
| RNase Inhibitor (40U / uL) | 0.5 μL |
| RTL تەتۈر كۆچۈرۈلگەن 2.0 (15U / uL) | 0.5 μL |
| 10 × HC RTL Buffer | 2 μL |
| يادروسىز سۇ | 20 μL |
ئىزاھات:
1) ئومۇمىي RNA نىڭ تەۋسىيە قىلىنغان مىقدارى 1ng ~ 1μg
2) mRNA نىڭ تەۋسىيە قىلىنغان مىقدارى 50ng ~ 100ng
Thermo-ۋېلىسىپىت مىنىش دائىملىق شەرت reaction ：
| تېمپېراتۇرا (° C) | ۋاقىت |
| 25 ° C.a | 5 مىنۇت |
| 55 ° C. | 10 مىنۇتb |
| 80 ° C. | 10 مىنۇت |
ئىزاھات:
1) ئەگەر ئىختىيارى Primer Mix ئىشلىتىلسە ، 25 سېلسىيە گرادۇسلۇق يوشۇرۇن باسقۇچ.
2) ئەگەر نىشان پىرىمات ئارىلاشمىسى ئىشلىتىلسە ، ° C 55 ~ ° C 10 ~ 30 مىنۇت.
RT-LAMP كېلىشىمنامىسى
| زاپچاسلار | ھەجىم | Final Concentration |
| قېلىپ RNA | ئىختىيارىي | ≥10 نۇسخا |
| dNTP Mix (10mM) | 3.5 μL | 1.4 mM |
| FIP / BIP Primers (25 ×) | 1 μL | 1.6 μM |
| F3 / B3 Primers (25 ×) | 1 μL | 0.2 μM |
| LoopF / LoopB Primers (25 ×) | 1 μL | 0.4 μM |
| RNase Inhibitor (40U / μL) | 0.5 μL | 20 U / Reaction |
| RTL تەتۈر كۆچۈرۈلگەن 2.0 (15U / μL) | 0.5 μL | 7.5 U / Reaction |
| Bst V2 DNA Polymerase (8U / μL) | 1 μL | 8 U / Reaction |
| MgSO4 (100mM) | 1.5 μL | 6 mM (جەمئىي 8 mM) |
| 10 × HC RTL Buffer (ياكى 10 × HC Bst V2 Buffer) | 2.5 μL | 1 × (2mM Mg2 +) |
| يادروسىز سۇ | 25 μL | - |
ئىزاھات:
1) قاينام-تاشقىنلىق ۋە مەركەزدىن قاچۇرۇش ئارقىلىق ئارىلاشتۇرۇڭ.تۇراقلىق تېمپېراتۇرا 65 سېلسىيە گرادۇستا 1 سائەت.
2) ئىككى بۇففېر ئۆز-ئارا مۇناسىۋەتلىك بولۇپ ، تەركىبى ئوخشاش.
ئىزاھات
1.بۇ مەھسۇلات -20 سېلسىيە گرادۇستا ساقلانغاندا ئاق قاتتىق ھاسىل بولىدۇ.-20 سېلسىيە گرادۇستىن چىقىرىپ مۇزغا 10 مىنۇت تۇرغۇزۇڭ.ئېرىگەندىن كېيىن سىلكىش ۋە ئارىلاشتۇرۇش ئارقىلىق ئىشلىتىشكە بولىدۇ.
2. CDNA مەھسۇلاتىنى -20 ° C ياكى -80 ° C قا ساقلىغىلى ياكى PCR ئىنكاسىغا دەرھال ئىشلىتىشكە بولىدۇ.
3. RNase نىڭ بۇلغىنىشىنىڭ ئالدىنى ئېلىش ئۈچۈن ، تەجرىبە رايونىنى پاكىز تۇتۇڭ ، مەشغۇلات جەريانىدا پاكىز پەلەي ۋە ماسكا تاقاڭ.
