ۋاكسىنا ۋىرۇسى قاپلاش ئېنزىم
ۋاكسىنىيە ۋىرۇسى قاپلاش فېرمېنتى قايتا ھاسىل بولىدىغان E. coli سىستىمىسىدىن ھاسىل قىلىنغان بولۇپ ، ۋاكسىنىيە قاپلاش ئېنزىمنىڭ گېنىنى توشۇيدۇ.بۇ يەككە ئېنزىم ئىككى تارماق (D1 ۋە D12) دىن تەركىب تاپقان بولۇپ ، ئۈچ خىل فېرمېنتلىق پائالىيەتكە ئىگە (D1 تارماق ئەترىتىنىڭ RNA triphosphatase ۋە guanylyltransferase) ۋە D12 تارماق ئەترىتىنىڭ گانىن مېتىل ترانسفېراسى).ۋاكسىنىيە ۋىرۇسى قاپلاش ئېنزىم دوپپا قۇرۇلمىسىنىڭ شەكىللىنىشىنى ئىلگىرى سۈرۈشتە ئۈنۈملۈك رول ئوينايدۇ ، ئۇ RNA نىڭ 5 ′ ئاخىرىغا 7 مېتىلگۇئانىلات قاپاق قۇرۇلمىسى (m7Gppp ، Cap 0) نى ئالاھىدە باغلىيالايدۇ.قاپاق قۇرۇلمىسى (Cap 0) ئېۋكارىيوتتىكى mRNA نىڭ مۇقىملىشىشى ، توشۇلۇشى ۋە تەرجىمىسىدە مۇھىم رول ئوينايدۇ.فېرمېنتلىق رېئاكسىيە ئارقىلىق RNA نى تۇتۇش ئۈنۈملۈك ۋە ئاددىي ئۇسۇل بولۇپ ، RNA نىڭ ۋىرۇسنى كۆچۈرۈش ، ئالماشتۇرۇش ۋە مىكرو ئوكۇل سېلىشتىكى RNA نىڭ مۇقىملىقى ۋە تەرجىمىسىنى كۆرۈنەرلىك ياخشىلايدۇ.
زاپچاسلار
ۋاكسىنىيە ۋىرۇسى قاپلاش ئېنزىم (10 U / μL)
10 × Capping Buffer
ساقلاش شارائىتى
ساقلاش ئۈچۈن -25 ～ - 15 repeated قايتا-قايتا مۇزلاش دەۋرىدىن ساقلىنىڭ）
ساقلىغۇچ
20 mM Tris-HCl (pH 8.0), 100 mM NaCl,
1mM DTT ، 0. 1mM EDTA ، 0. 1% Triton X- 100 ،% 50 گلىتسېرىن.
بىرلىك ئېنىقلىمىسى
Vaccinia ۋىرۇسى قاپلاش ئېنزىمنىڭ بىر قىسمى 37 سېلسىيە گرادۇسلۇق بىر سائەتتە كەچ سائەت 10 دا GTP نى 80nt لىق خاتىرىگە كىرگۈزۈش ئۈچۈن كېرەكلىك ئېنزىمنىڭ مىقدارى دەپ ئېنىقلىما بېرىلگەن.
سۈپەت كونترول
Exonuclease:10U ۋاكسىنىيە ۋىرۇسى قاپلاش ئېنزىمنىڭ 1μg λ-Hind III ھەزىم قىلىش DNA 37 37 at 16 سائەت 16 سائەت ئىچىدە ئاگاروزا گېلى ئېلېكتروفورىسى تەرىپىدىن بېكىتىلگەن بۇزۇلۇش پەيدا قىلمايدۇ.
Endonuclease:10U ۋاكسىنىيە ۋىرۇسى قاپلاش ئېنزىمنىڭ 1μg λDNA بىلەن 37 16 16 سائەت 16 سائەت ئىچىدە ئاگاروزا گېلى ئېلېكتروفورىسى تەرىپىدىن بېكىتىلگەن بۇزۇلۇش پەيدا قىلمايدۇ.
Nickase:10U ۋاكسىنىيە ۋىرۇسى قاپلاش ئېنزىمنىڭ 1 μ mg pBR322 بىلەن 37 at at 16 سائەت 16 سائەت ئىچىدە ئاگاروزا گېلى ئېلېكتروفورىسى تەرىپىدىن بېكىتىلگەن بۇزۇلۇش پەيدا قىلمايدۇ.
RNase:10U ۋاكسىنىيە ۋىرۇسى قاپلاش ئېنزىم 1.6μg MS2 RNA بىلەن 37 سائەتتە 4 سائەت 4 سائەت ئىچىدە ئاگاروزا گېلى ئېلېكتروفورىسى تەرىپىدىن بېكىتىلگەن بۇزۇلۇش پەيدا قىلمايدۇ.
1.coli DNA:10U ۋاكسىنىيە ۋىرۇسى قاپلاش ئېنزىم TaqMan qPCR ئارقىلىق E. coli گېن گۇرۇپپىسىدىكى DNA نىڭ بار-يوقلۇقى تەكشۈرۈلۈپ ، E. coli 16S rRNA چېكەتكىسىگە ماس كېلىدۇ.E. coli گېن گۇرۇپپىسىنىڭ DNA بۇلغىنىشى ≤1 E. coli گېنى.
2.باكتېرىيە Endotoxin: LAL- سىناق ، جۇڭگونىڭ Pharmacopoeia IV 2020 نەشرىگە ئاساسەن ، گېلى چەكلەش ئۇسۇلى ، ئومۇمىي قائىدە (1143).باكتېرىيەنىڭ ئىچكى ئاجراتما مىقدارى EU10 EU / mg بولۇشى كېرەك.
ئىنكاس سىستېمىسى ۋە شەرتلىرى
1. قاپلاش كېلىشىمنامىسى (ئىنكاس مىقدارى: 20 μL)
بۇ جەريان 10μg RNA (≥100 nt) نىڭ چەكلەش ئىنكاسىغا ماس كېلىدۇ ، تەجرىبە تەلىپىگە ئاساسەن كېڭەيتكىلى بولىدۇ.
I) 1.5 مىللىمېتىرلىق مىكرو تۇرۇبا يولىدا 10μg RNA بىلەن يادروسىز H2O نى بىرلەشتۈرۈپ ، ئەڭ ئاخىرقى ھەجىمى 15.0 µL.* 10 aping Capping Buffer: 0.5M Tris-HCl, 50 mM KCl, 10 mM MgCl2, 10 mM DTT, (25 ℃, pH 8.0)
2) 65 at دا 5 مىنۇت قىزىتىڭ ، ئاندىن مۇز مۇنچىسىدىن 5 مىنۇت قاينىتىڭ.
3) كۆرسىتىلگەن تەرتىپ بويىچە تۆۋەندىكى زاپچاسلارنى قوشۇڭ
| Component | Volume |
| رەتلەنگەن RNA (≤10μg ، ئۇزۇنلۇقى 100 nt) | 15 μL |
| 10 × Capping Buffer * | 2 μL |
| GTP (10 mM) | 1 μL |
| SAM (2 mM) | 1 μL |
| ۋاكسىنىيە ۋىرۇسى قاپلاش ئېنزىم (10U / μL) | 1 μL |
* 10 aping Capping Buffer ： 0.5 M Tris-HCl, 50 mM KCl, 10 mM MgCl2, 10 mM DTT, (25 ℃, pH8.0)
4) 37 سېلسىيە گرادۇستا 30 مىنۇت تۇرغۇزۇڭ ، RNA ھازىر چەكلىنىپ تۆۋەن ئېقىندىكى پروگراممىلارغا تەييارلاندى.
2. 5 ′ تېرمىنال بەلگە ئىنكاسى (ئىنكاس مىقدارى: 20 μL)
بۇ كېلىشىم RNA غا 5´ ترىفوسفات بار دەپ بەلگە قويۇلغان بولۇپ ، تەلەپكە ئاساسەن كېڭەيتكىلى بولىدۇ.بەلگە بىرلەشتۈرۈشنىڭ ئۈنۈمى RNA: GTP ، شۇنداقلا RNA ئەۋرىشكىسىدىكى GTP مەزمۇنىنىڭ تەسىرىگە ئۇچرايدۇ.
1) مۇۋاپىق مىقداردىكى RNA ۋە يادروسىز H2O نى 1.5 مىللىمېتىرلىق مىكرو تۇرۇبا يولىغا بىرلەشتۈرۈپ ، ئەڭ ئاخىرقى ھەجىمى 14.0 µL.
2) 65 at دا 5 مىنۇت قىزىتىڭ ، ئاندىن مۇز مۇنچىسىدىن 5 مىنۇت قاينىتىڭ.
3) كۆرسىتىلگەن تەرتىپ بويىچە تۆۋەندىكى زاپچاسلارنى قوشۇڭ.
| Component | Volume |
| رەتلەنگەن RNA | 14 μL |
| 10 × Capping Buffer | 2 μL |
| GTP mix ** | 2 μL |
| SAM (2 mM) | 1 μL |
| ۋاكسىنىيە ۋىرۇسى قاپلاش ئېنزىم (10U / μL) | 1 μL |
** GTP MIX GTP ۋە ئاز ساندىكى بەلگىلەرنى كۆرسىتىدۇ.GTP نىڭ قويۇقلۇقى ئۈچۈن پايدىلىنىڭto Note 3.
4) 37 سېلسىيە گرادۇستا 30 مىنۇت تۇرغۇزۇڭ ، RNA 5 ′ ئاخىرىغا بەلگە قويۇلغان ھەمدە تۆۋەنكى ئېقىنغا تەييارلانغان
قوللىنىشچان پروگراممىلار
1. تەرجىمە ماقالىسىدىن ئىلگىرى mRNA نى تۇتۇش / in vitro تەرجىمىسى
2. mRNA نىڭ 5´ ئاخىرىغا بەلگە قويۇش
ئىشلىتىش خاتىرىسى
1.Vaccinia Capping Enzyme بىلەن ئىنكۇبلىنىشتىن ئىلگىرى RNA نىڭ ئېرىتمىسىنى قىزىتىش خاتىرىنىڭ 5´end دىكى ئىككىنچى قۇرۇلمىنى چىقىرىپ تاشلايدۇ.داڭلىق قۇرۇلمىلىق 5´ends بىلەن خاتىرىلەنگەن ۋاقىتنى 60 مىنۇتقا ئۇزارتىڭ.
2. قاپلاش رېئاكسىيەسىگە ئىشلىتىلىدىغان RNA نى ئىشلىتىشتىن بۇرۇن ساپلاشتۇرۇپ ، يادروسىز سۇدا توختىتىش كېرەك.EDTA ھازىر بولماسلىقى ، ھەل قىلىش چارىسى تۇزسىز بولۇشى كېرەك.
3. 5´ ئاخىرىغا بەلگە قويۇش ئۈچۈن ، GTP ئومۇمىي قويۇقلۇقى رېئاكسىيەدىكى mRNA نىڭ قۇتۇپ قويۇقلۇقىنىڭ 1-3 ھەسسىسىگە تەڭ بولۇشى كېرەك.
4. رېئاكسىيە سىستېمىسىنىڭ ھەجىمىنى ئەمەلىي ئەھۋالغا ئاساسەن كىچىكلەتكىلى ياكى تۆۋەنلەتكىلى بولىدۇ.
