بىۋاسىتە PCR Kit
مۈشۈك نومۇرى: HCR2020A
ئۆسۈملۈك بىۋاسىتە PCR يۈرۈشلۈك ئۆسۈملۈك يوپۇرمىقى ، ئۇرۇقى قاتارلىقلارنى بىۋاسىتە كېڭەيتىشكە ماس كېلىدۇ ، پولىساخارىد ۋە پولىفېنول بولمىغان ئۆسۈملۈك ئەۋرىشكىسىنى يۇقىرى ئۈنۈملۈك تەكشۈرۈشكە ئىشلىتىشكە بولىدۇ.يۆنىلىشلىك تەدرىجىي تەرەققىياتنى ئاساس قىلغان بىۋاسىتە كۈچەيتىلگەن DNA پولىمېرازا ئۆسۈملۈكلەردىكى PCR چەكلىگۈچكە بەرداشلىق بېرەلەيدۇ.شۇنىڭ بىلەن بىللە ، ئۇ يۇقىرى قۇۋۋەتلەش ئىقتىدارىنى ساقلايدۇ ، بۇ 5 كىلوگرام ئىچىدە DNA پارچىلىرىنى كېڭەيتىشكە ماس كېلىدۇ.يۈرۈشلۈك زاپچاستىكى ئۆزگىچە Lysis بۇففېر A يېڭى ياكى توڭلىتىلغان ئۆسۈملۈك توقۇلمىلىرىنى لەيلەشكە ئىشلىتىلىدۇ.مەشغۇلات قىلىش ئاسان ، لىزاتنى ساپلاشتۇرماي كۈچەيتىشنىڭ قېلىپى قىلىپ ئىشلىتىشكە بولىدۇ.بۇ سىستېمىدا قوغداش دورىسى بار بولۇپ ، خام ئەۋرىشكە قايتا-قايتا مۇزلىغان ۋە ئېرىگەندىن كېيىن ئۈنۈملۈك كۈچەيتىلىدۇ.2 × ئۆسۈملۈك بىۋاسىتە ئۇستام ئارىلاشتۇرۇش پەقەت كۈچەيتمە ئىنكاس قايتۇرۇش ئۈچۈن پەقەت دەسلەپكى ۋە قېلىپلارنى قوشۇشى كېرەك ، بۇ ئارقىلىق تۇرۇبا يولى مەشغۇلاتىنى ئازايتىپ ، بايقاشنىڭ كىرگۈزۈش ۋە نەتىجىنىڭ كۆپىيىشىنى ياخشىلايدۇ.
زاپچاسلار
| زاپچاسلار | 50 RXNS | 200 RXNS |
| 2 × ئۆسۈملۈك بىۋاسىتە ئۇستام ئارىلاش | 1.25 ml | 4 × 1.25 ml |
| ئۆسۈملۈك بىۋاسىتە Lysis Buffer A. | 5 ml | 20 مىللىلېتىر |
| ئۆسۈملۈك بىۋاسىتە Lysis Buffer B * | 5 ml | 20 مىللىلېتىر |
* ئۆسۈملۈك بىۋاسىتە Lysis Buffer B ئىختىيارىي رېئاكتور بولۇپ ، ئەۋرىشكەنىڭ ساقلاش ۋاقتىنى ئۇزارتىش ئۈچۈن ئۆسۈملۈك بىۋاسىتە Lysis Buffer A نى نېيتراللاشتۇرۇشقا ئىشلىتىلىدۇ.ئۇنى ئەمەلىي ئەھۋالغا ئاساسەن ئىشلىتىشكە بولىدۇ.
ساقلاش شەرتلىرى
2 Direct ئۆسۈملۈك بىۋاسىتە ئۇستام ئارىلاشتۇرۇڭ ، -30 ~ -15 at دە ساقلاڭ ، قايتا-قايتا مۇزلاش ۋە ئېرىتىشتىن ساقلىنىڭ.بىۋاسىتە لىز بۇففېر زاۋۇتى ، -30 ~ -15 ℃ ياكى 2 ~ 8 at دە ساقلاڭ.
تەجرىبە جەريانى
ئۈلگە بىر تەرەپ قىلىش-ئۆسۈملۈك يوپۇرمىقى
بىۋاسىتە ئۇسۇل:ياش يوپۇرماق ئىشلىتىش تەۋسىيە قىلىنىدۇ.مۇقىم دىئامېتىرى 0.5 - 3 مىللىمېتىر كېلىدىغان تۆشۈكنى ئىشلىتىپ كىچىك ۋە بىردەك ئەۋرىشكە ئېلىڭ ، ئاندىن ئەۋرىشكىنى بىۋاسىتە PCR سىستېمىسىغا قوشۇڭ (50 مىللىمېتىرلىق سىستېما تەۋسىيە قىلىنىدۇ).دىققەت ، ئەۋرىشكىنىڭ PCR ئېرىتمىسىدە ئىكەنلىكى ۋە تۇرۇبا تېمىغا قارشى ئەمەسلىكىنى جەزملەشتۈرۈڭ.ئەگەر بىۋاسىتە PCR ئۇزۇن پارچىلار ۋە مۇرەككەپ ئەۋرىشكىلەرنى كېڭەيتىشكە ئىشلىتىلسە ، دىئامېتىرى كىچىكرەك (0.5 - 1 مىللىمېتىر) بولغان قېلىپنى قېلىپ قىلىپ ئىشلىتىپ ، تېخىمۇ ياخشى نەتىجىگە ئېرىشكىلى بولىدۇ.
گىرىم قىلىش ئۇسۇلى:ياش يوپۇرماق ئىشلىتىش تەۋسىيە قىلىنىدۇ.كىچىككىنە بىر پارچە يوپۇرماقنى (دىئامېتىرى تەخمىنەن 1 - 3 مىللىمېتىر) ئېلىپ ، ئۇنى 20 مىللىمېتىرلىق ئۆسۈملۈك بىۋاسىتە لىز بۇففېر ئابغا قويۇڭ ۋە ئىمكانقەدەر ئۇۋۇلاڭ (بۇ باسقۇچنى 100 مىللىمېتىرلىق تۇرۇبا ئۇچى بىلەن يوپۇرماقنى سىقىپ چىقارغىلى بولىدۇ. to mash).ئەگەر چوڭ ھەجىمدىكى يوپۇرماق توقۇلمىلىرى ئىشلىتىلسە (7 مىللىمېتىردىن ئېشىپ كەتمىسە) ، سۇيۇلدۇرۇش بۇففېرنىڭ ئاۋازىنى 50 مىللىمېتىرغا يەتكۈزۈڭ.يوپۇرماقلار يەرگە چۈشكەندىن كېيىن ، ئېرىتمىسى يېشىل كۆرۈنۈشى كېرەك.قىسقىغىنە مەركەزدىن ئايرىلغاندىن كېيىن ، PCR سىستېمىسىغا خاسىيەتلىك ماددىنىڭ 1 مىللىمېتىرنى ئىنكاس قېلىپى قىلىپ قوشۇڭ.
ئىسسىقلىق لىمزى ئۇسۇلى:ياش يوپۇرماق ئىشلىتىش تەۋسىيە قىلىنىدۇ.كىچىككىنە بىر پارچە يوپۇرماقنى (دىئامېتىرى تەخمىنەن 1 - 3 مىللىمېتىر) ئېلىپ ، 20 مىللىمېتىر ئۆسۈملۈك بىۋاسىتە لىز بۇففېر A غا قويۇپ ، 95 سېلسىيە گرادۇستا 5 مىنۇتتىن 10 مىنۇتقىچە قىزىتىڭ.لەيلىمە ۋاقىتنى لايلاش تەس بولغان يوپۇرماقلارغا مۇۋاپىق ئۇزارتقىلى بولىدۇ (20 مىنۇتتىن ئېشىپ كەتمەيدۇ).ئەگەر چوڭ ھەجىمدىكى يوپۇرماق توقۇلمىلىرى ئىشلىتىلسە (7 مىللىمېتىردىن ئېشىپ كەتمىسە) ، سۇيۇلدۇرۇش بۇففېرنىڭ ئاۋازىنى 50 مىللىمېتىرغا يەتكۈزۈڭ.قىزىتقاندىن كېيىن ، قىسقا ۋاقىت ئىچىدە مەركەزدىن قاچۇرۇپ ، PCR سىستېمىسىغا ئىنكاس قېلىپى سۈپىتىدە 1 مىللىمېتىر خاسىيەتلىك ماددا قوشۇڭ.
ئۈلگە بىر تەرەپ قىلىش- ئۆسۈملۈك ئۇرۇقى
گىرىم قىلىش ئۇسۇلى:باش تېرىسىدىن پايدىلىنىپ دىئامېتىرى 5 مىللىمېتىر كېلىدىغان ئۇرۇقنى كېسىپ ، ئۇنى 100 مىللىمېتىر ئۆسۈملۈك بىۋاسىتە لىز بۇففېر A غا قوشۇڭ ، ھەمدە تۇرۇبا ئۇچى ياكى باشقا قوراللار بىلەن ئەۋرىشكىنى ئېزىڭ.Vortex قىسقا ۋاقىت ئىچىدە ئۆينىڭ تېمپېراتۇرىسىدا 3 - 5 مىنۇت تۇرغۇزۇڭ.ئۇرۇق ئەۋرىشكىسىنىڭ سۇيۇقلاندۇرۇش سۇيۇقلۇقىغا چۆكۈپ كەتكەنلىكىنى جەزملەشتۈرۈڭ.قىسقىغىنە مەركەزدىن ئايرىلغاندىن كېيىن ، PCR سىستېمىسىغا خاسىيەتلىك ماددىنىڭ 1 مىللىمېتىرنى ئىنكاس قېلىپى قىلىپ قوشۇڭ.
ئىسسىقلىق لىمزى ئۇسۇلى:باش تېرىسى ئىشلىتىپ دىئامېتىرى 5 مىللىمېتىر كېلىدىغان ئۇرۇقنى كېسىپ ، 100 مىللىمېتىر ئۆسۈملۈك بىۋاسىتە لىز بۇففېر A غا سېلىڭ ، 95 سېلسىيە گرادۇستا 5 مىنۇتتىن 10 مىنۇتقىچە قىزىتىڭ.لەيلىمە ۋاقىتنى لايلاش تەس بولغان يوپۇرماقلارغا مۇۋاپىق ئۇزارتقىلى بولىدۇ (30 مىنۇتتىن ئېشىپ كەتمەيدۇ).قىزىتقاندىن كېيىن ، قىسقا ۋاقىت ئىچىدە مەركەزدىن قاچۇرۇپ ، PCR سىستېمىسىغا ئىنكاس قېلىپى سۈپىتىدە 1 مىللىمېتىر خاسىيەتلىك كېمە قوشۇڭ.
a.قايچا ياكى باشقا قوراللارمۇ مۇۋاپىق چوڭلۇقتىكى ئەۋرىشكىنى كېسىشكە ئىشلىتىلىدۇ.ئەگەر مۇشت ياكى قايچا قايتا ئىشلىتىلسە ، ھەر قېتىم ئىشلىتىشتىن ئىلگىرى% 2 ناترىي گىئوخلورىت ئېرىتمىسى بىلەن پاكىزلاپ ، ئەۋرىشكە ئارىسىدىكى ئۆز-ئارا بۇلغىنىشنىڭ ئالدىنى ئېلىش كېرەك.
b.ئۆسۈملۈك بىۋاسىتە لىز بۇففېر ئىشلىتىشتىن بۇرۇن تولۇق ئېرىپ كەتكەنلىكىگە كاپالەتلىك قىلىڭ.ئەگەر بۇففېر يېپىشقاق ياكى چۆكمىسى بولسا ، 37 at دە قىزىتىپ ، ئىشلىتىشتىن بۇرۇن تولۇق ئېرىتكىلى بولىدۇ.
c.رېئاكسىيە سىستېمىسىدىكى قېلىپنىڭ ئاۋازىنى ئۆسۈملۈك ماتېرىياللىرى ۋە سۇيۇقلاندۇرۇلغان سۇيۇقلۇقنىڭ ئوخشىماسلىقىغا ئاساسەن مۇۋاپىق تەڭشىگىلى بولىدۇ.
ئۆسۈملۈك Lysis Buffer
بۇ مەھسۇلات تەركىبىدىكى ئۆسۈملۈك بىۋاسىتە لىز بۇففېر A كۆپىنچە ئۆسۈملۈك توقۇلمىلىرىنىڭ گېنلىرىنى قويۇپ بېرىش ئۈچۈن قاتتىق ئەلالاشتۇرۇلغان بولۇپ ، خام ئۆسۈملۈكلەرنى 4 at قىسقا مۇددەت ساقلاشقا ماس كېلىدۇ.ئەگەر ئەۋرىشكىنى ئۇزۇنراق ساقلاشقا توغرا كەلسە (مەسىلەن ، 1 - 2 ئاي) ، خاسىيەتلىك كېمەنى يېڭى EP تۇرۇبىسىغا يۆتكەپ ، -20 at دە ساقلاش تەۋسىيە قىلىنىدۇ.ئەۋرىشكىلەرنى تېخىمۇ مۇقىم ساقلاش ئۈچۈن ، يۆتكەلگەن خاسىيەتلىك كېمىگە ئوخشاش مىقداردىكى ئۆسۈملۈك بىۋاسىتە Lysis Buffer B نى قوشۇڭ ، ياخشى ئارىلاشتۇرۇڭ ۋە -20 at دە ساقلاڭ.مۇقىم ساقلاش ۋاقتى ئۆسۈملۈك ئەۋرىشكىسى ۋە ھالىتى بىلەن ئوخشىمايدۇ.
ئىنكاس سىستېمىسى
| ddH2O | 20.0 µl | 50.0 µl |
| 2 × ئۆسۈملۈك بىۋاسىتە ئۇستام ئارىلاشa | 10.0 µl | 25.0 µ |
| Primer 1 (10 µM) | 0.8 µl | 2.0 µl |
| Primer 2 (10 µM)b | 0.8 µl | 2.0 µl |
| ئۆسۈملۈك يوپۇرمىقى / خام جەۋھەر ئەۋرىشكىسى(ئەۋرىشكە بىر تەرەپ قىلىشقا قاراڭ) | 0.5 - 3 مىللىمېتىر يوپۇرماق دىسكىسى / x µl | 0.5 - 3 مىللىمېتىر يوپۇرماق دىسكىسى / x µl |
a.ئۇنىڭدا Mg بار2+ئەڭ ئاخىرقى قويۇقلۇقى 2 mM.
b.ھەر بىر قەغەزگە ئاخىرقى قويۇقلۇقى 0.4μM ئىشلىتىش تەۋسىيە قىلىنىدۇ.پىرىمېرنى ھەددىدىن زىيادە ئىشلىتىش ئەھمىيەتسىز كۈچەيتىشنى كەلتۈرۈپ چىقىرىدۇ.
c.ئىشلىتىلگەن ئەۋرىشكىنىڭ مىقدارىنى ئەمەلىي ئەھۋالغا ئاساسەن تەڭشىگىلى بولىدۇ.خام لايلانغان ئەۋرىشكىنىڭ يەككە ئىنكاسىدا ئىشلىتىلگەن مىقدارنى ئومۇمىي ئىنكاسنىڭ% 2 -% 20 ئارىلىقىدا تەڭشىگىلى بولىدۇ.بەك كۆپ ئەۋرىشكە ئىشلىتىش كۈچەيتمەسلىك مەغلۇبىيىتىنى كەلتۈرۈپ چىقىرىدۇ.
ئىنكاس پروگراممىسى
| Steps | تېمپېراتۇرا | ۋاقىت |
| Initial Denaturation | 98 ℃ | 5 min |
| Denaturation | 95 ℃ | 10 سېكۇنت |
| Annealing | 58 ~ 72 ℃ | 15 سېكۇنت |
| كېڭەيتىش | 72 ℃ | 30 سېكۇنت |
| ئاخىرقى كېڭەيتىش | 72 ℃ | 5 min |
a.دەسلەپكى ئايلىنىش (98 ℃ ، 5 مىنۇت) ئۆسۈملۈك توقۇلمىلىرىنىڭ لىزسىنى ئىلگىرى سۈرۈپ ، PCR كېڭەيتىشكە ئىشلىتىلىدىغان گېن گۇرۇپپىسىنى قويۇپ بېرىدۇ.ۋاقىتنى قىسقارتماڭ ياكى تېمپېراتۇرىنى تۆۋەنلىتىڭ.
b.ئۇنى دەسلەپكى Tm قىممىتىگە تەڭ ياكى Tm قىممىتىدىن 2 ~ 4 ℃ يۇقىرى ئورۇنغا قويۇش تەۋسىيە قىلىنىدۇ.بۇ مەھسۇلاتتا ئىشلىتىلگەن بىۋاسىتە كۈچەيتىلگەن DNA پولىمېراسى ئادەتتىكى تاق DNA پولىمېراسىغا ئوخشىمايدۇ ، ھەمدە رېئاكسىيەنىڭ تۇتاشتۇرۇش تېمپېراتۇرىسىغا ئالاھىدە تەلەپ قويدى high يۇقىرى تۇتاشتۇرۇش تېمپېراتۇرىسىنى ئىشلىتىش ئەھمىيەتسىز كۈچەيتىشنى ئۈنۈملۈك تۆۋەنلىتىدۇ ۋە كۈچەيتىش ئۈنۈمىنى ئۆستۈرىدۇ.مۇرەككەپ قېلىپلارغا نىسبەتەن ، قوشۇمچە تېمپېراتۇرىنى تەڭشەش ۋە ئۇزارتىش ۋاقتىنى ئۇزارتىش ئارقىلىق ئۈنۈملۈك كۈچەيتكىلى بولىدۇ.
c.ئەگەر كۈچەيتمە مەھسۇلاتنىڭ ئۇزۇنلۇقى ≤1 kb بولسا ، ئۇزارتىش ۋاقتى 30 سېكۇنت / kb قىلىپ بېكىتىلىدۇ.ئەگەر كۈچەيتمە مەھسۇلاتنىڭ ئۇزۇنلۇقى> 1 kb بولسا ، ئۇزارتىش ۋاقتى 60 سېكۇنت / kb قىلىپ بېكىتىلىدۇ.
d.مۇرەككەپ ئەۋرىشكە ياكى ئەۋرىشكە ئېلىش ئۈنۈمى تۆۋەن ئەۋرىشكە ئۈچۈن ، دەۋرىيلىك سانىنى مۇۋاپىق ھالدا 40-50 دەۋرىگە كۆپەيتكىلى بولىدۇ.
قوللىنىشچان پروگراممىلار
ئۇ ئۆسۈملۈك توقۇلمىلىرىنى بىۋاسىتە كۈچەيتىش ۋە پولىساخارىد ۋە پولىفېنول بولمىغان ئۆسۈملۈك ئەۋرىشكىسىنى يۇقىرى ئۈنۈملۈك تەكشۈرۈشكە ماس كېلىدۇ.
ئىزاھات
پەقەت تەتقىقات ئۈچۈن ئىشلىتىلىدۇ.دىئاگنوز قويۇش تەرتىپىدە ئىشلىتىشكە بولمايدۇ.
1. خام ئۆسۈملۈكنى كۈچەيتىش ياكى بىۋاسىتە كۈچەيتىش ئۈچۈن ، سىناقنى باشلاشتىن بۇرۇن ساپلاشتۇرۇلغان گېن گۇرۇپپىسىنى ئاكتىپ كونترول قىلىپ ، سىستېما ، پىرىسلاش ۋە مەشغۇلاتنىڭ توغرا بولۇشىغا كاپالەتلىك قىلىش تەۋسىيە قىلىنىدۇ.
2. بۇ زاپچاستا ئىشلىتىلگەن بىۋاسىتە كۈچەيتكۈچ DNA پولىمېراسى كۈچلۈك كوررېكتورلۇق پائالىيىتىگە ئىگە.ئەگەر TA كلونلاشنى ئەمەلگە ئاشۇرۇشقا توغرا كەلسە ، ئادېنېننى قوشۇشتىن بۇرۇن DNA نى تازىلاش تەۋسىيە قىلىنىدۇ.
3. دەسلەپكى لايىھىلەش يېتەكچىسى ：
a.پىرىمېرنىڭ 3 ′ ئاخىرىدىكى ئاخىرقى ئاساسى G ياكى C بولۇشى تەۋسىيە قىلىنىدۇ.
b.پىرىماتنىڭ 3 ′ ئاخىرىدىكى ئاخىرقى 8 بازىدا ئۇدا ماسلاشماسلىقتىن ساقلىنىش كېرەك.c.قەغەزنىڭ 3 ′ ئۇچىدىكى چاچ ياساش قۇرۇلمىسىدىن ساقلىنىڭ.
d.ئالدى كۆرسەتكۈچ بىلەن تەتۈر يۆنىلىشلىك كۆرسەتكۈچنىڭ Tm قىممىتىدىكى پەرق 1 than دىن ئېشىپ كەتمەسلىكى ، Tm قىممىتىنى 60 ~ 72 to غا تەڭشەش كېرەك (Primer Premier 5 Tm قىممىتىنى ھېسابلاش تەۋسىيە قىلىنىدۇ).
e.قېلىپ بىلەن ماسلاشمىغان قوشۇمچە قوشۇمچە دەسلەپكى تەرتىپلەر ، دەسلەپكى Tm قىممىتىنى ھېسابلىغاندا ئۆز ئىچىگە ئالماسلىقى كېرەك.
f.دەسلەپكى كۆرسەتكۈچنىڭ GC مەزمۇنىنىڭ% 40-% 60 بولۇشى تەۋسىيە قىلىنىدۇ.
g.دەسلەپكى قەدەمدە A ، G ، C ۋە T نىڭ ئومۇمىي تارقىلىشى مۇمكىن قەدەر بولۇشى كېرەك.GC ياكى AT مەزمۇنى يۇقىرى رايونلارنى ئىشلىتىشتىن ساقلىنىڭ.
h.پىرىزما ئىچىدە ياكى ئىككى پىرىمېر ئوتتۇرىسىدا 5 ياكى ئۇنىڭدىن ئارتۇق بازىنىڭ تولۇقلاش تەرتىپىنىڭ بولۇشىدىن ساقلىنىڭ ۋە ئىككى پىرىماتنىڭ 3 ′ ئاخىرىدىكى 3 ياكى ئۇنىڭدىن ئارتۇق بازىنىڭ تولۇقلاش تەرتىپىنىڭ بولۇشىدىن ساقلىنىڭ.
i.NCBI BLAST فۇنكسىيەسىنى ئىشلىتىپ ، دەسلەپكى قەدەمنىڭ كونكرېتلىقىنى تەكشۈرۈپ ، ئەھمىيەتسىز كېڭەيتىشنىڭ ئالدىنى ئالىدۇ.
