EndoFree Plasmid Maxi Kit
بۇ زاپچاس 150 - 300 مىللىلېتىر باكتېرىيە ئېرىتمىسىدىن بىر كېچىدىلا يېتىلدۈرۈشكە ماس كېلىدۇ ، ياخشىلانغان SDS- ئىشقارلىق لىز ئۇسۇلى ئارقىلىق باكتېرىيەنى يالغانغا چىقىرىدۇ.خام جەۋھەر ئۆزگىچە Endotoxin Scavenger بىلەن بىرلەشتۈرۈلۈپ ، مەركەزدىن قاچۇرۇش ئارقىلىق ئايرىپ ، ئىچكى ئاجراتمىلارنى يوقىتىدۇ.ئاندىن ، سىلىتسىي گېلى پەردىسى يۇقىرى تۇز ۋە تۆۋەن pH شارائىتىدا ئېرىتمىسىدىكى پىلازما DNA بىلەن تاللىنىدۇ.ئۇنىڭدىن كېيىن يۇيۇش سۇيۇقلۇقى قوشۇلۇپ ، ئىممۇنىتېت ۋە باشقا باكتېرىيە تەركىبلىرىنى يوقىتىدۇ.ئاخىرىدا ، كرېمنىي ماترىسسا پەردىسىدىن ساپ پلازما DNA نى يوقىتىش ئۈچۈن تۆۋەن تۇزلۇق ، يۇقىرى pH يوقىتىش بۇففېر ئىشلىتىلىدۇ.سىلىتسىي يىلىمى پەردىسىدە ئالاھىدە سۈمۈرۈلۈش پەردىسى ئىشلىتىلگەن بولۇپ ، ئىستون بىلەن ستوننىڭ سۈمۈرۈلۈش مىقدارى پەرقى ئىنتايىن كىچىك ، تەكرارلىنىشچانلىقى ياخشى.فېنول ، خلوروفورم ۋە باشقا زەھەرلىك رېئاكتورلار تەلەپ قىلىنمايدۇ ، شۇنداقلا ئېتانولنىڭ يامغۇر يېغىش باسقۇچلىرىمۇ ئەمەس.بۇ يۈرۈشلۈك زاپچاسنى تېز سۈرئەتتە 0.2 -1.5 مىللىگىرام ساپ يۇقىرى كۆپەيتىلگەن پلازما DNA نى چىقىرىشقا ئىشلىتىشكە بولىدۇ ، ئېلىش نىسبىتى% 80-% 90.بۇ زاپچاستا ئۆزگىچە جەريان فورمۇلا ئىشلىتىلگەن بولۇپ ، ئېندوكسىننى يوقىتىدۇ ، ئېندوكسىننىڭ مىقدارى ئىنتايىن تۆۋەن ، ھۈجەيرىلەرنى يەتكۈزۈش ئۈنۈمى ناھايىتى ياخشى.ئېلىنغان پلازما ئېنزىم ھەزىم قىلىش ، PCR ، ۋىرۇس كۆچۈرۈش ، ئۆزگەرتىش ، تەرتىپلەش ۋە باشقا مولېكۇلا بىئولوگىيە تەجرىبىسىدە بىۋاسىتە ئىشلىتىشكە بولىدۇ.
ساقلاش شارائىتى
RNaseA -30 ~ -15 at دە ساقلىنىشى ھەمدە ≤0 at توشۇلۇشى كېرەك.
Endotoxin Scavenger نى 2 ~ 8 at دە بىر ئاي ساقلىغىلى بولىدۇ ، -30 ~ -15 at دە ئۇزۇن مۇددەت ساقلىغىلى بولىدۇ.ۋە ≤0 at دە توشۇلدى.
باشقا زاپچاسلارنى ئۆي تېمپېراتۇرىسىدا (15 ~ 25 ℃) ساقلاش ھەمدە ئۆي تېمپېراتۇرىسىدا توشۇش كېرەك.
زاپچاسلار
| زاپچاسلار | 10RXNS |
| RNase A. | 750 μL |
| Buffer P1 | 75 مىللىمېتىر |
| Buffer P2 | 75 مىللىمېتىر |
| Buffer P4 | 75 مىللىمېتىر |
| Endotoxin Scavenger | 25 مىللىلېتىر |
| Buffer PW | 2 × 22 ml |
| Buffer TB | 20 مىللىلېتىر |
| FastPure DNA Maxi ستونلىرى (ھەر بىرى 50ml لىق يىغىش تۇرۇبىسىدا) | 10 |
| Endotoxin ھەقسىز يىغىش تۇرۇبىسى | 2 × 5 |
RNaseA:10 mg / ml ، RNA نى چىقىرىۋېتىشكە ئىشلىتىلىدۇ.
Buffer P1:باكتېرىيە ئاسما ئۇففېر ، تۇنجى ئىشلىتىشتىن بۇرۇن Buffer P1 غا RNaseA نى قوشۇڭ.
Buffer P2:باكتېرىيە لىزىسى بۇففېر (SDS / NaOH نى ئۆز ئىچىگە ئالىدۇ).
Buffer P4:نېيتراللاشتۇرغۇچ.
Endotoxin Scavenger:يىرىك پلازما جەۋھىرىدىن ئېندوكسىننى ئۈنۈملۈك چىقىرىڭ.
Buffer PW:بۇففېرنى يۇيۇڭ ، ئىشلىتىشتىن بۇرۇن ئېتانولنىڭ مىقدارىنى قوشۇڭ.
Buffer TB:elution buffer.
FastPure DNA Maxi ستونلىرى:پىلاستىك DNA قوبۇل قىلىش ستونلىرى.
Collection Tubes 50 ml:سۈزگۈچ يىغىش تۇرۇبىسى.
Endotoxin ھەقسىز يىغىش تۇرۇبىسى:پىلاستىك DNA توپلاش تۇرۇبىسى.
تەييار ماتېرىياللار
مۇتلەق ئېتانول ، ئىزوپروپانول ، 50 مىللىمېتىر يۇمىلاق ئۈستۈنكى مەركەزدىن ياسالغان نەيچە ۋە 50 مىللىمېتىر ئېندوكسىن يوق.centrifuge تۇرۇبىسى.
قوللىنىشچان پروگراممىلار
بۇ مەھسۇلات 150 - 300 مىللىلېتىر باكتېرىيە ئېرىتمىسىدىن پلازما ماددىسىنى كەڭ كۆلەمدە ئېلىشقا ماس كېلىدۇبىر كېچىدىلا مەدەنىيەتلىك.
تەجرىبە جەريانى
1. 150 - 200 مىللىلىتىر (300 مىللىلىتىردىن ئېشىپ كەتمەيدۇ) باكتېرىيە ئېرىتمىسىنى بىر كېچىدىلا يېتىلدۈرۈڭتەخمىنەن 11000 rpm (12000 × g) 1 - 2 مىنۇت.خاسىيەتلىك ئادەمنى تاشلاپ ، باكتېرىيە توپلاڭ.
50 50 مىللىلېتىردىن ئارتۇق باكتېرىيە ئېرىتمىسىنى يىغىۋالغاندا ، باكتېرىيە ئېرىتمىسى ، مەركەزدىن قاچۇرۇش ، خاسىيەتلىك كېمە ۋە باشقا باسقۇچلارنى ئوخشاش 50 مىللىمېتىر نەيچىدە تاشلىۋېتىش ئارقىلىق باكتېرىيە توپلىغىلى بولىدۇ.
كۆپ قېتىم.
2. بۇففېر P1 دىن 7.5 مىللىلېتىر قوشۇڭ (RNaseA نىڭ Buffer P1 غا قوشۇلغان ياكى قوشۇلمىغانلىقىنى تەكشۈرۈپ بېقىڭ)تۇرۇبا باكتېرىيەسى بار بولۇپ ، قاينام ياكى تۇرۇبا يولى ئارقىلىق تولۇق ئارىلاشتۇرۇلىدۇ.
This بۇ باسقۇچتىكى باكتېرىيەنىڭ تولۇق ئەسلىگە كېلىشى ھوسۇل ئېلىشتا ئىنتايىن مۇھىم ، قايتا قوزغالغاندىن كېيىن باكتېرىيە توپى بولماسلىقى كېرەك.ئەگەر تولۇق ئارىلاشتۇرۇلمىغان باكتېرىيە توپى بولسا ، ئۇ لىزغا تەسىر قىلىپ ، تۆۋەن مەھسۇلات ۋە ساپلىقنى كەلتۈرۈپ چىقىرىدۇ.ئەگەر OD600 باكتېرىيە ئېرىتمىسى 0.65 بولسا ، 150 مىللىلېتىر باكتېرىيە ئېرىتمىسىدىن ئايرىغاندا 7.5 مىللىمېتىرلىق بۇففېر P1 نى ئىشلىتىش تەۋسىيە قىلىنىدۇ.OD600 بولسا 0.75 بولغاندا ، بۇففېر P1 دىن 8 مىللىلېتىر ئىشلىتىش ھەمدە بۇففېر P2 ۋە P4 نىڭ مىقدارىنى ماس ھالدا ئۆزگەرتىش كېرەك.ئەگەر باكتېرىيە ئېرىتمىسىنىڭ مىقدارى 200 مىللىمېتىرغا يەتكۈزۈلسە ، بۇنىڭ تەۋسىيە قىلىنىدۇبۇففېر P1 ، P2 ۋە P4 نىڭ مىقدارى ماس ھالدا ئاشۇرۇلىدۇ.
3. 2-قەدەمدىن باكتېرىيە ئاسماسىغا 7.5 مىللىلېتىر بۇففېر P2 نى قوشۇپ ئاستا-ئاستا ئارىلاشتۇرۇپ 6 - 8 گىچە.ۋاقىت ۋە ئۆي تېمپېراتۇرىسىدا 4 - 5 مىنۇت تۇرغۇزۇڭ.
Ently يۇمشاقلىق بىلەن ئارىلاشتۇرۇڭ.Vortexing گېن گۇرۇپپىسىنىڭ پارچىلىنىشىنى كەلتۈرۈپ چىقىرىدۇ ، نەتىجىدە ئېلىنغان پىلازمىدا گېن گۇرۇپپىسىنىڭ DNA پارچىلىرى پەيدا بولىدۇ.بۇ ۋاقىتتا ، ھەل قىلىش چارىسى يېپىشقاق ۋە سۈزۈك بولۇپ ، باكتېرىيەنىڭ تولۇق لايلانغانلىقىنى كۆرسىتىپ بېرىدۇ.پىلاستىك ماددىلارنىڭ بۇزۇلۇشىدىن ساقلىنىش ۋاقتى 5 مىنۇتتىن ئېشىپ كەتمەسلىكى كېرەك.ئەگەر ھەل قىلىش چارىسى ئېنىق بولمىسا ، باكتېرىيە بەك كۆپ بولۇشى مۇمكىنتولۇق بولمىغان لىز ، شۇڭا باكتېرىيەنىڭ مىقدارىنى مۇۋاپىق ئازايتىش كېرەك.
4. باففېر P4 دىن 7.5 مىللىلېتىر باكتېرىيەنى 3-قەدەمدىن قوشۇپ ، دەرھال 6 - 8 قېتىم ئاستا-ئاستا تەتۈر ئايلاندۇرۇپ ، ھەل قىلىش چارىسىنىڭ بۇففېر P2 نى پۈتۈنلەي نېيتراللاشتۇرۇشىغا يول قويۇڭ.بۇ ۋاقىتتا ئاق رەڭلىك يامغۇر يېغىشى كېرەك.Centrifuge تەخمىنەن 11000 rpm (12000 × g) دىن 10 مىنۇتتىن 15 مىنۇتقىچە ، خاسىيەتلىك ماددا بىلەن ئېھتىياتچانلىق بىلەن يېڭى 50 مىللىمېتىر يۇمىلاق ئۈستۈنكى مەركەزدىن ياسالغان نەيچىگە پۈركۈپ ، ئۆزى ساقلىنىڭ.لەيلىمە ئاق چۆكۈشنى ئارزۇ قىلىڭ.
Buff Buffer P4 نى قوشۇڭ ھەمدە دەرھال ياخشى ئارىلاشتۇرۇڭ.ئاق چۆكمە ھەل قىلىش چارىسىدە تەكشى تەقسىملەنگۈچە تۇرۇبىنى قويۇپ ، نېيتراللىشىشقا تەسىر كۆرسىتىدىغان يەرلىك ھۆل-يېغىننىڭ ئالدىنى ئېلىش كېرەك.ئەگەر مەركەزدىن قاچۇرۇشتىن ئىلگىرى بىرلىككە كەلگەن ئاق رەڭلىك سۇيۇقلۇق چۆكمىسى بولمىسا ھەمدە مەركەزدىن قاچقاندىن كېيىن خاسىيەتلىك ماددا ئېنىق بولمىسا ، نەيچە بولىدۇ.centrifuged for another 5 min.
5. 4-قەدەمدىن خاسىيەتلىك كېمىگە Endotoxin Scavenger نىڭ ھەجىمىنىڭ 1 ھەسسىسىنى (خاسىيەتلىك ئاۋازنىڭ% 10 ، تەخمىنەن 2.2 مىللىمېتىر) قوشۇڭ ۋە تەتۈر ئارىلاشتۇرۇڭ.ئېرىتمىنى مۇز مۇنچىسىغا قويۇڭ ياكى ئېزىلگەن مۇزغا (ياكى توڭلاتقۇ توڭلاتقۇغا) 5 مىنۇت سېلىڭ ، ھەل قىلىش چارىسى قالايمىقان ۋە سۈزۈك (ياكى يەنىلا)سەل قالايمىقان) ، ئاندا-ساندا بىر نەچچە قېتىم ئارىلاشتۇرۇڭ.
End Endotoxin Scavenger خاسىيەتلىك ئادەمگە قوشۇلغاندىن كېيىن ، خاسىيەتلىك ماددا قالايمىقانلىشىدۇ ، ئەمماخاسىيەتلىك ئادەم مۇز مۇنچىسىدا سوۋۇغاندىن كېيىن ئېنىق (ياكى سەل قالايمىقان) بولۇشى كېرەك.
6. خاسىيەتلىك كېمە ئۆي تېمپېراتۇرىسىغا (> 25 ℃) 10 - 15 مىنۇت قويۇلغاندىن كېيىن ، ئۇ قالايمىقان بولۇپ قالىدۇ.ئۇنىڭ تېمپېراتۇرىسى ئۆينىڭ تېمپېراتۇرىسىغا ئۆرلەيدۇ.ئاندىن خاسىيەتلىك ئادەمنى تەتۈر ئارىلاشتۇرۇپ ئارىلاشتۇرۇش كېرەك.
Δ ئەگەر ئۆينىڭ تېمپېراتۇرىسى تۆۋەنرەك بولسا ياكى ئېلىش ۋاقتىنى قىسقارتماقچى بولسىڭىز ، خاسىيەتلىك كېمە 37 ~ 42 ℃ سۇ مۇنچىسىغا 5 مىنۇتتىن 10 مىنۇتقىچە سىلىنسا بولىدۇ ، كېيىنكى قەدەمنى خاسىيەتلىك كېمەدىن كېيىن ئېلىپ بارغىلى بولىدۇ.تۇراقسىز بولۇپ قالىدۇ.
7. خاسىيەتلىك كېمە تەخمىنەن 11000 rpm (12000 × g) ئەتراپىدا 10 مىنۇت ئۆي تېمپېراتۇرىسىدا (تېمپېراتۇرا چوقۇم 25 be) بولۇشى كېرەك.ئۈستۈنكى سۇ باسقۇچىدا DNA بار ، تۆۋەنكى كۆك مايلىق فازا قەۋىتىدە ئىچكى ئاجراتما ۋە باشقا بۇلغانمىلار بار.يۆتكەڭيېڭى تۇرۇبىغا DNA بولغان سۇ باسقۇچى ۋەمايلىق قەۋەتنى تاشلاڭ.
Cent مەركەزدىن قاچۇرۇش جەريانىدا تېمپېراتۇرا 25 تىن يۇقىرى بولۇشى كېرەك ، چۈنكى ئۈنۈملۈك باسقۇچ ئايرىمايدۇتېمپېراتۇرا بەك تۆۋەن بولسا يۈز بېرىدۇ.
Δ ئەگەر فازا ئايرىش ئۈنۈملۈك بولمىسا ، مەركەزدىن قاچۇرۇش تېمپېراتۇرىسىنى 30 ℃ ۋە تەڭشىگىلى بولىدۇمەركەزدىن قاچۇرۇش ۋاقتىنى 15 مىنۇتقا ئۇزارتقىلى بولىدۇ.
كۆك مايلىق قەۋەتنى سۈمۈرمەڭ ، چۈنكى ئۇنىڭدا ئېندوكسىن ۋە باشقا بۇلغانمىلار بار.
مېخانىزم
توختاپ قېلىش لىزى نېيتراللىشىش
.5 7.5 مىللىمېتىرلىق Buffer P1 نى قوشۇڭ
.5 7.5 مىللىمېتىرلىق Buffer P2 نى قوشۇڭ
.5 7.5 مىللىمېتىرلىق Buffer P4 نى قوشۇڭ
Endotoxin ئېلىۋېتىش
End Endotoxin Scavenger نىڭ خاسىيەتلىك ھەجىمىنىڭ 1 ھەسسىسىنى قوشۇڭ
باغلاش ۋە يۇيۇش
Is ئىزوپروپانولنىڭ مىقدارىنىڭ 0.5 ھەسسىسىنى قوشۇڭ
10 10 ml Buffer PW نى قوشۇڭ
10 10 ml Buffer PW نى قوشۇڭ
Elution
1 1 - 2 مىللىمېتىر بۇففېر تۇبېركۇليوزى ياكى Endotoxin يوق ddH2O نى قوشۇڭ
