M-MLV Neoscript تەتۈر ترانسكرىپسىيەسى
Neoscript تەتۈر ترانسكرىپسىيەسى مولونېي قاتىل ئاق قان ۋىرۇسىنىڭ پەيدا بولۇشى ۋە E.coli دىكى ئىپادىسىنىڭ M-MLV گېنىنىڭ ئۆزگىرىشىنى تەكشۈرۈش ئارقىلىق ئېرىشكەن تەتۈر كۆچۈرۈلگەن.ئېنزىم RNase H پائالىيىتىنى چىقىرىپ تاشلايدۇ ، تېخىمۇ يۇقىرى تېمپېراتۇرىغا بەرداشلىق بېرەلەيدۇ ، ھەمدە يۇقىرى تېمپېراتۇرا تەتۈر كۆچۈرۈشكە ماس كېلىدۇ.شۇڭلاشقا ، RNA يۇقىرى قاتلاملىق قۇرۇلما ۋە ئالاھىدە بولمىغان ئامىللارنىڭ cDNA بىرىكمىسىگە پايدىسىز تەسىرىنى تۈگىتىشكە پايدىلىق ، ھەمدە تېخىمۇ يۇقىرى مۇقىملىق ۋە تەتۈر كۆچۈرۈش بىرىكمە ئىقتىدارىغا ئىگە.فېرمېنتنىڭ مۇقىملىقى ۋە تەتۈر كۆچۈرۈلۈش بىرىكمە ئىقتىدارى بار.
زاپچاسلار
1.200 U / μL Neoscript تەتۈر ترانسكرىپسىيەسى
2.5 × بىرىنچى دەرىجىلىك بۇففېر (ئىختىيارىي)
* 5 × بىرىنچى قاتاردىكى بۇففېردا DNTP يوق ، ئىنكاس سىستېمىسىنى تەييارلىغاندا DNTP قوشۇڭ
تەۋسىيە قىلىنغان ئىلتىماس
1.بىر باسقۇچلۇق qRT-PCR.
2.RNA ۋىرۇسىنى بايقاش.
ساقلاش ھالىتى
ئۇزۇن مۇددەت ساقلاش ئۈچۈن -20 ° C ، ئىشلىتىشتىن بۇرۇن ياخشى ئارىلاشتۇرۇپ ، دائىم مۇزلاشتىن ساقلىنىش كېرەك.
بىرلىك ئېنىقلىمىسى
بىر بىرلىك پولى (A) • oligo (dT) ئارقىلىق 10 سېلسىيە گرادۇستا 10 مىنۇتتا 1 nmol dTTP نى ئۆز ئىچىگە ئالىدۇ.25قېلىپ / primer سۈپىتىدە.
سۈپەت كونترول
1.SDS-PAGE ئېلېكتروفورېتىك ساپلىقى% 98 تىن يۇقىرى.
2.كۈچەيتىش سەزگۈرلۈكى ، تۈركۈمگە بۆلۈپ كونترول قىلىش ، مۇقىملىق.
3.تاشقى يادرو پائالىيىتى يوق ، تاشقى مەنبەلىك ئىچكى ئاجراتما ياكى بۇلغىنىش بولمايدۇ
بىرىنچى زەنجىرسىمان ئىنكاس ھەل قىلىش چارىسى
1.رېئاكسىيە ئارىلاشمىسىنى تەييارلاش
| زاپچاسلار | ھەجىم |
| Oligo (dT)12-18 Primer ياكى Random Primera ياكى Gene Specific Primersb | 50 pmol |
| 50 pmol (20-100 pmol) | |
| 2 pmol | |
| 10 mM dNTP | 1 μL |
| قېلىپ RNA | ئومۇمىي RNA≤ 5μg;mRNA≤ 1 μg |
| RNase-free dH2O | 10 μL |
ئىزاھات:a / b: تەجرىبە ئېھتىياجىڭىزغا ئاساسەن ئوخشىمىغان تىپتىكى پىرىمېرلارنى تاللاڭ.
2.65 سېلسىيە گرادۇستا 5 مىنۇت قىزىتىڭ ، مۇزدا 2 مىنۇت تېز سوۋۇتىڭ.
3.يۇقارقى سىستېمىغا تۆۋەندىكى زاپچاسلارنى قوشۇڭ ، ئومۇمىي مىقدارى 20µL غا ئاستا-ئاستا ئارىلاشتۇرۇڭ:
| زاپچاسلار | توم (μL) |
| 5 × بىرىنچى قاتاردىكى بۇففېر | 4 |
| Neoscript تەتۈر ترانسكرىپسىيەسى (200 U / μL) | 1 |
| RNase inhibitor (40 U / μL) | 1 |
| RNase-free dH2O | 20 μL |
4. تۆۋەندىكى شەرتلەر بويىچە ئىنكاس قايتۇرۇڭ:
.
.
5.Neoscript تەتۈر ترانسكرىپسىيەنى ئاكتىپلاش ۋە ئىنكاسنى ئاخىرلاشتۇرۇش ئۈچۈن 5 مىنۇتتا 95 at دە قىزىتىڭ.
6.تەتۈر ترانسكرىپسىيە مەھسۇلاتلىرىنى بىۋاسىتە PCR رېئاكسىيەسى ۋە فلۇئورېسسېنسىيە مىقدار PCR ئىنكاسىدا ئىشلىتىشكە بولىدۇ ، ياكى -20 at دە ئۇزۇن ۋاقىت ساقلىغىلى بولىدۇ.
PCR R.eaction ：
1.رېئاكسىيە ئارىلاشمىسىنى تەييارلاش
| زاپچاسلار | مەركەزلىشىش |
| 10 × PCR Buffer (dNTP ھەقسىز ، Mg² + ھەقسىز) | 1 × |
| dNTPs (ھەر بىر dNTP 10mM) | 200 μM |
| 25 mM MgCl2 | 1-4 mM |
| تاق DNA پولىمېراسى (5U / μL) | 2-2.5 U. |
| Primer 1 (10 μM) | 0.2-1 μM |
| Primer 2 (10 μM) | 0.2-1 μM |
| قېلىپa | ≤10% بىرىنچى زەنجىرسىمان ئىنكاس ھەل قىلىش چارىسى (2 μL) |
| ddH2O | To 50 μL |
ئىزاھات:جاۋاب: ئەگەر بەك كۆپ بىرىنچى زەنجىرسىمان ئىنكاس ھەل قىلىش چارىسى قوشۇلسا ، PCR ئىنكاسى تورمۇزلىنىشى مۇمكىن.
2.PCR ئىنكاس تەرتىپى
| قەدەم | تېمپېراتۇرا | ۋاقىت | ۋېلىسىپىت |
| ئالدىن كېلىشىش | 95 ℃ | 2-5 مىنۇت | 1 |
| Denaturation | 95 ℃ | 10-20 سېكۇنت | 30-40 |
| Annealing | 50-60 ℃ | 10-30 سېكۇنت | |
| كېڭەيتىش | 72 ℃ | 10-60 سېكۇنت |
ئىزاھات
1.42 ℃ ~ 55 range ئارىلىقىدا تەتۈر كۆچۈرۈلگەن تېمپېراتۇرىنى ئەلالاشتۇرۇشقا ماس كېلىدۇ.
2.ئۇنىڭ مۇقىملىقى تېخىمۇ ياخشى ، يۇقىرى تېمپېراتۇرا تەتۈر ترانسكرىپسىيەنى كۈچەيتىشكە ماس كېلىدۇ.ئۇنىڭدىن باشقا ، RNA نىڭ مۇرەككەپ قۇرۇلما رايونلىرىدىن ئۈنۈملۈك ئۆتۈشكە پايدىلىق.شۇنداقلابىر قەدەملىك كۆپ ئىقتىدارلىق فلۇئورېسسېنسىيە مىقدارى RT-PCR بايقاشقا ماس كېلىدۇ.
3.ھەرخىل PCR كۈچەيتمە فېرمېنتلىرى بىلەن ماسلىشىشچانلىقى يۇقىرى بولۇپ ، يۇقىرى سەزگۈرلۈكتىكى RT-PCR ئىنكاسىغا ماس كېلىدۇ.
4.يۇقىرى سەزگۈرلۈك بىر باسقۇچلۇق فتور فېرمېنسىيىلىك مىقدار RT-PCR ئىنكاسىغا ماس كېلىدۇ ، قېلىپلارنىڭ تۆۋەن قويۇقلۇقىنى بايقاش نىسبىتىنى ئۈنۈملۈك ئۆستۈرىدۇ.
5.CDNA كۈتۈپخانىسى قۇرۇلۇشىغا ماس كېلىدۇ.
